本文主要解析了穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建的原理和穩(wěn)定細(xì)胞系建立的流程，及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建的區(qū)別與。幫助我們選擇合適的細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

　　真核蛋白表達(dá)的方式有兩種：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建）。根據(jù)自身真核蛋白表達(dá)的目的選擇合適的轉(zhuǎn)染方法非常重要。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染持續(xù)時(shí)間較短，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，3-4天就會(huì)丟失。因此可以得到少量的蛋白。相對(duì)于此，穩(wěn)定抵不住篩選是一個(gè)長(zhǎng)期的過程，需要足夠的耐心和細(xì)心。

　　穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建原理

　　真核蛋白表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系建立的原理是，將我們所要的目的基因真核到宿主細(xì)胞上，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，目的基因可以穩(wěn)定的表達(dá)，在通過抗生素的不斷加壓篩選，zui終得到構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的過程。相對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)持續(xù)周期長(zhǎng)，細(xì)胞整合穩(wěn)定，能夠滿足后期對(duì)蛋白的大量需求。

　　穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建  實(shí)驗(yàn)流程

　　1.細(xì)胞培養(yǎng)

　　細(xì)胞培養(yǎng)是真核蛋白蛋白實(shí)驗(yàn)中的*步，原核利用大腸桿菌，真核蛋白表達(dá)是培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，常用的真核蛋白表達(dá)細(xì)胞有CHO,HEK293細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞系建立選擇CHO細(xì)胞。

　　細(xì)胞復(fù)蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細(xì)胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細(xì)胞復(fù)蘇的關(guān)鍵是快復(fù)，防止在解凍過程中，產(chǎn)生的水珠形成冰晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇一般步驟如下：

　　1）預(yù)先加熱水浴鍋，溫度至37-40℃，并在離心管中準(zhǔn)備好10ml培養(yǎng)基

　　2）從液氮罐或冰箱中取出細(xì)胞，迅速放進(jìn)預(yù)熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動(dòng)，使其受熱均勻

　　3）當(dāng)凍存管內(nèi)*融化時(shí)，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有10ml培養(yǎng)基的離心管中

　　4）離心5min，去除上清，得到沉淀

　　5）用培養(yǎng)基懸浮沉淀，并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)培養(yǎng)

　　細(xì)胞復(fù)蘇后，生長(zhǎng)一段時(shí)間，95%的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)良好，說明細(xì)胞復(fù)蘇成功。

　　2.穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建（一）

　　以Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑為例進(jìn)行先瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，不同轉(zhuǎn)染試劑參考說明書

　　1）將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞按照1-3x10^5接種到6孔板中，加入2-4ml的*培養(yǎng)基，混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜

　　2）無菌狀態(tài)下配置如下溶液：a 用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋2ug的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒

　　b 用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋25ul的Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑（血清的存在會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，因此要使用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染）

　　3）將ab溶液混合并搖勻，室溫下放置30min左右

　　4）細(xì)胞培養(yǎng)至80%單層左右，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1ml的無血清培養(yǎng)基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)

　　5）將轉(zhuǎn)染液倒出，換為*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)

　　3.穩(wěn)定細(xì)胞系建立

　　24-72h加入選擇性抗生素進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株篩選，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定抗生素的*濃度，確定抗生素對(duì)所選細(xì)胞的zui低作用濃度。1）提前一天接種細(xì)胞與24孔板中，待第二天長(zhǎng)成25%單層為宜，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。

　　2）第二天將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0,50,100,200,400,800，1000ug/ml）。

　　3）培養(yǎng)15天左右絕大多數(shù)細(xì)胞死亡抗生素濃度為準(zhǔn)，一般為400-800ug/ml，篩選細(xì)胞時(shí)可適當(dāng)提高濃度

　　4）二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h后按照1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代，使用預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的抗生素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。后挑選單克隆，有限稀釋法挑取單克隆。有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來做連續(xù)的10倍稀釋，每稀釋一梯度都在9孔板中培養(yǎng)，生長(zhǎng)一周左右再次挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)3次。

　　5）Western blot或ELISA檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，挑取多個(gè)單克隆進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，篩選出表達(dá)量zui高的克隆傳代保存。

　　zui終篩選出穩(wěn)定高表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，相對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建在后續(xù)可以節(jié)約大量的時(shí)間和成本，是滿足活性蛋白大量制備的方法。

　　真核系統(tǒng)蛋白表達(dá)的操作較為繁瑣，困難，有一定的操作難點(diǎn)，相對(duì)原核表達(dá)得到的蛋白更具天然活性，同酵母表達(dá)相似，可以實(shí)現(xiàn)蛋白的各種修飾，只是真核蛋白表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)蛋白的復(fù)雜、修飾。在制藥，活性因子生產(chǎn)方面有很大應(yīng)用。